細(xì)胞免疫熒光主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)抗原抗體檢測(cè)，適用于細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)。那么細(xì)胞免疫熒光有哪些方法和步驟呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

二、間接法（較為常用）

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

三、操作步驟

1.倒出培養(yǎng)液。

2.潤(rùn)洗，將1ml SDwan全培養(yǎng)基沿培養(yǎng)板緩慢打入，蓋上蓋子，輕柔搖晃，先使用1ml的槍沿側(cè)壁吸出潤(rùn)洗后，再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。

3.吹打，加入2ml SDwan全培養(yǎng)基，打在培養(yǎng)板底部，然后反復(fù)抽打，直至培養(yǎng)板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该?。（吹打之后放置，后使用之前都要反?fù)吹打）

4.將細(xì)胞爬片放入24孔板，每孔一個(gè)（注意每個(gè)孔只放一個(gè)，不要多放，注意檢查）。

5.往（3）中吹打后的細(xì)胞液中繼續(xù)加4ml的SDwan全培養(yǎng)基（即總計(jì)6ml）。將細(xì)胞液分裝到24孔板中（分裝之前吹打，防止細(xì)胞沉降而造成的不均勻），每個(gè)板500ul。注意事項(xiàng)：每一步打開細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，防止細(xì)胞培養(yǎng)板蓋時(shí)勿使細(xì)胞培養(yǎng)板蓋朝上放置。

6.在將細(xì)胞培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱之前，請(qǐng)噴酒精。

7.細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)之內(nèi)使用，最好20小時(shí)。沿側(cè)壁吸出培養(yǎng)液。1PBS潤(rùn)洗2次，沿側(cè)壁打入1ml或500ul PBS，輕柔搖勻2-3次后，沿側(cè)壁吸出。

8.Pfu number/細(xì)胞數(shù)=pfuV/細(xì)胞數(shù)=感染復(fù)數(shù) 感染復(fù)數(shù)為2，加病毒20ul + 480ul SD培養(yǎng)液 感染復(fù)數(shù)為15，加病毒150ul + 480ul SD培養(yǎng)液 病毒滴數(shù)經(jīng)提前測(cè)定為1*10-7pfu/ml

9.先加SD培養(yǎng)基再加病毒。（24h或48h之后進(jìn)行（10））

10固定細(xì)胞：吸出上清，加4%PFA（組織固定液），1ml/孔，室溫下30min。

11.PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。

12.細(xì)胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T為Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室溫1h。

13.封閉：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween)  BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔，室溫下2h。

14.一抗：用封閉液按1：100（比例依照抗體說(shuō)明書）稀釋，300ul/孔，4攝氏度過(guò)夜。

15.PBST（Tween）洗3次，10min/次 。

16.二抗（4℃抗體熒光抗體）：用PBST（Tween）按1：1000稀釋，300ul/孔，室溫避光1h。

17.PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室溫避光10分鐘。

18.PBS 洗2次，1ml/孔，立馬抽出。

19.載玻片上滴加封片液，細(xì)胞爬片的細(xì)胞層與封片液接觸。

20.熒光共聚焦顯微鏡觀察。

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