熒光素是一種常見的生物發(fā)光報告子，用于體外成螢光素酶。這種螢火蟲螢光素酶的水溶性底物（通常來自Photinuspyralis）

利用ATP和Mg2+作為共因子在氧氣的存在。通過ATP的利用，反應可以進一步用于指示能量或生命的存在是為了起到生死攸關(guān)

的污點的作用。

螢火蟲螢光素酶是研究基因最chang用的報告基因之一表達由于其ji端的敏感性，以及快速，易于使用的系統(tǒng)。螢光素酶用于監(jiān)測

細菌、培養(yǎng)細胞以及轉(zhuǎn)基因植物或動物。它是一種約61kDa的蛋白質(zhì)，作為單體具有活性，不需要加工其活動。螢火蟲螢光素

酶通過催化熒光素的氧化羧化作用產(chǎn)生具有任何已知生物發(fā)光中最gao效率之一的反應。螢光素活性可以通過與啟動子/增強子的

相關(guān)性來表征基因調(diào)控元素。優(yōu)化后化學發(fā)光反應和調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄活性。

本手冊旨在介紹一種簡單、經(jīng)濟、可靠的方法，用于在體外報告系統(tǒng)中檢測熒光素酶活性。

生物發(fā)光反應：

幾個因素可能會影響反應的靈敏度，包括溫度、pH或底物濃度我們建議使用pH為7.8的緩沖液，并在使用前將所有試劑預熱至

室溫，以獲得最佳結(jié)果。GoldBio還建議添加在測定緩沖液中過量的ATP和Mg2+用于更好的反應。

當熒光素被添加到螢光素酶樣品中時，會立即產(chǎn)生閃光在0.3-0.5秒內(nèi)達到峰值強度。然后，光線開始迅速衰減一半壽命約為0.5

-1.0分鐘。但當輔酶A最初加入測定緩沖液時能夠防止快速反應衰變延長了反應2-5分鐘。如果稍后添加到反應中混合物，輔酶A也促進額外的二次閃光。

Gold Bio推薦基于Yuichi Oba等人（2003）：

-100mM Tris-HCl（pH 7.8）

-5mM MgCl2

-250μM CoA

-150μM ATP（Fraga，2008）

-150μg/mL d-熒光素（GoldBio）

一些研究人員還添加了二硫蘇糖醇（DTT）或EDTA等成分（Steghans，1998）。您可以調(diào)整您的特定分析緩沖液以達到最佳

效果滿足您的需求。我們建議對您的特定細胞進行動力學曲線的初步測試以獲得最佳效果。

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